賈寧，目前在南方科技大學擔任副教授，主要研究微生物與宿主免疫系統(tǒng)。2022 年，她曾入選《麻省理工科技評論》“35 歲以下科技創(chuàng)新 35 人”亞太區(qū)榜單。
圖 | 賈寧（來源：南科大官網(wǎng)）
不到一年時間，好消息再次傳來。前不久，她和合作者成功揭開 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的“神秘面紗”，讓學界對于 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的理解得以加深，為開發(fā)相關(guān)基因編輯工具并將其用于臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
(資料圖片)
研究中，借助生物化學、微生物學、結(jié)構(gòu)生物學等手段，她和團隊揭示了如下分子機制：細菌可以利用 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的免疫防御能力，抵御外源質(zhì)粒的入侵。
這一成果為了解 IV-A 型復合物的結(jié)構(gòu)和功能做出重大貢獻，也為進一步確定 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的體內(nèi)功能鋪平了道路。
日前，相關(guān)論文以《IV-A 型 CRISPR-Csf 復合物：組裝、dsDNA 靶向和 CasDinG 募集》（Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment）為題發(fā)在 Molecular Cell（IF 16），CuiNing 是第一作者，賈寧和南科大副教授黃鴻達擔任共同通訊作者。
圖 | 相關(guān)論文（來源：Molecular Cell）
盡管投稿過程耗時一年多。但是賈寧表示：“最終，評審專家評價稱我們‘用冷凍電鏡解析了所有重要的功能狀態(tài)，特別是首次捕捉到了 IV 型 Csf 系統(tǒng)與效應(yīng)蛋白 CasDinG 復合物的結(jié)構(gòu)，代表著 IV 型研究的一個重大飛躍’?？吹竭@樣的評價我真的很高興，這是對我們工作的極大肯定。”
（來源：Molecular Cell）
“神秘”的 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)
作為細菌的獲得性免疫機制，CRISPR-Cas 系統(tǒng)能夠“記住”曾入侵過的噬菌體或外源質(zhì)粒，當后者再次入侵時，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以切斷它們的基因組，讓其無法復制和表達，從而抵御噬菌體或質(zhì)粒等外源核酸的入侵。
由于能夠特異性地識別 DNA/RNA，CRISPR-Cas 系統(tǒng)已被開發(fā)成為一種高效的基因編輯工具，并被廣泛用于生物技術(shù)、臨床應(yīng)用、基礎(chǔ)研究等方面。
研究 CRISPR-Cas 技術(shù)的兩位科學家也因此獲得 2020 年諾貝爾化學獎。同時，該技術(shù)曾經(jīng)三次被 Science 評為年度十大科學進展，可見其在科學領(lǐng)域的重要意義。
根據(jù)效應(yīng)蛋白的組成，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可被分為兩大類：第一類（Class1）效應(yīng)蛋白，是由多個 Cas 蛋白組成的復合物；第二類（Class2）效應(yīng)蛋白，由單個 Cas 蛋白組成。
目前，已經(jīng)得到鑒定的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)累計包含六種（I-VI）。除了 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)外，其他類型的功能和作用機制，均已得到詳細報道。
其中，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)是最為神秘的一類。該系統(tǒng)又可進一步分為從 IV-A 到 IV-E 等五種亞型。
IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的特殊之處在于，它更多存在于質(zhì)粒上而非存在于染色體上。并且，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)對于同一宿主的其他質(zhì)粒具有極強的靶向性，因此有可能會介導宿主中不同質(zhì)粒之間的競爭。
耐藥菌感染，是當下臨床治療中的棘手問題。更嚴重的是，通過質(zhì)粒水平的轉(zhuǎn)移，耐藥基因會在細菌中傳播擴散，進而加劇微生物耐藥所帶來的公共衛(wèi)生安全問題。
近期，在臨床分離的多種耐藥肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒上，學界也發(fā)現(xiàn)了 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的存在。另外，有研究表明該系統(tǒng)可以靶向其他質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)移基因，這暗示著 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)可能具備對抗攜帶耐藥基因質(zhì)粒的能力。假如這一能力確實存在，將有希望用于耐藥菌感染的治療。
而在目前已經(jīng)得到鑒定的 6 類 CRISPR-Cas 系統(tǒng)中，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)是唯一一種結(jié)構(gòu)與功能均處于未知狀態(tài)的系統(tǒng)。
正是 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的神秘作用機制以及巨大的臨床應(yīng)用潛力，引起了賈寧等人的極大興趣。
識別 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的“廬山真面目”
為了揭開該系統(tǒng)的“真面目”，該團隊使用銅綠假單胞菌的 IV-A 型系統(tǒng)，來對效應(yīng)蛋白進行共同表達。
這時，效應(yīng)蛋白會和 crRNA 形成效應(yīng)復合物 CsfcrRNA。但是，課題組發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的特征蛋白 Csf4（CasDinG）并不存在其中。
接著，通過生化實驗課題組證實 CsfcrRNA 可以特異性地識別靶 dsDNA，后又利用冷凍電鏡單顆粒方法解析了 CsfcrRNA 與靶 dsDNA 結(jié)合復合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，借此揭示了 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的組裝、crRNA 成熟以及靶 dsDNA 識別的分子機制。
結(jié)構(gòu)分析和生化實驗的結(jié)果顯示，相比 I、II、V 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，IV-A 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)能夠識別的 PAM 序列范圍更廣，這說明其具備廣泛的 DNA 識別特性，暗示著其具有更大的應(yīng)用價值。
而在最初的復合物結(jié)構(gòu)中，他們并沒有發(fā)現(xiàn) CasDinG 這一復合物。但是，在 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)抵御外源質(zhì)粒入侵時，CasDinG 發(fā)揮著必不可少的作用。
為了探究 CasDinG 的具體功能，該團隊又把 CasDinG 單獨地純化出來，通過 X- 射線晶體學技術(shù)解析了 CasDinG 的結(jié)構(gòu)。
后來，他們發(fā)現(xiàn) CasDinG 是一種 5′-3′DNA 解旋酶，依賴于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）而存在。
盡管 CasDinG 不能直接與 CsfcrRNA 形成復合物，但是 CasDinG 具有結(jié)合 DNA 的能力。
于是課題組猜測：是不是 CasDinG 能被 CsfcrRNA-dsDNA 三元復合物所招募？
為驗證這一猜想，他們設(shè)計了不同版本的 dsDNA，最終證明上述猜測完全正確。
更有意思的是，進一步的生化實驗結(jié)果顯示，在 ATP 的存在之下，CasDinG 能將靶 dsDNA 從 CsfcrRNA-dsDNA 復合物中解旋下來。
為進一步探明上述現(xiàn)象，他們利用冷凍電鏡解析了 3? CasDinG-CsfcrRNA-dsDNA 的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) CasDinG 能夠和不同的 Csf2 亞基相互作用，這說明 CasDinG 可能會沿著 Csf2 亞基進行滑動從而解開靶 dsDNA。
而被解旋的單鏈 DNA，很有可能被細胞中的 DNA 酶所降解，從而導致目標質(zhì)粒的降解。
綜合以上發(fā)現(xiàn)，該團隊提出了一款模型，涵蓋了 IV-A 型 CRISPR-Csf 復合物組裝、靶向 dsDNA、招募 CasDinG 蛋白、以及 dsDNA 解離等過程。
目前，應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具是 DNA 靶向的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)和 CRISPR-Cas12 系統(tǒng)，兩者都屬于第二類（Class2）效應(yīng)蛋白，即只由一個效應(yīng)蛋白組成，組成上相對簡單因此更容易進行操作。
但是，在識別 DNA 的時候，它們都得依賴靶向基因位點上特定的短 DNA 序列，這種序列的名字叫做 PAM 序列。并且，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)和 CRISPR-Cas12 系統(tǒng)可以識別的 PAM 序列比較少，導致其適用范圍較為局限。
因此，開發(fā)新型基因編輯系統(tǒng)、拓寬 DNA 序列的編輯范圍，是領(lǐng)域內(nèi)的重要研究方向。
雖然 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)，是由多個蛋白組成的復合物。但是，用于編碼這一系統(tǒng)的基因僅為 3159bp，比目前廣泛應(yīng)用的 spCas9（4104 bp）還要小。
這意味著，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)更容易被遞送到細胞之內(nèi)，臨床應(yīng)用潛力十分可觀。而且，它能識別更加寬泛 PAM 位點，可編輯范圍相對較大，適用范圍也更廣闊。
此外，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)也能存在于耐藥菌株之中，故能和耐藥基因相互關(guān)聯(lián)。這樣一來就能形成一個內(nèi)源系統(tǒng)，從而有潛力用于對抗日益嚴重的耐藥菌傳播。
同時，作為一種多亞基的復合物，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)可以在多個位置耦聯(lián)其他效應(yīng)蛋白比如表觀修飾酶、熒光蛋白等，進而能夠帶來更大的應(yīng)用范圍。
如前所述，在所有 6 大類 CRISPR-Cas 系統(tǒng)中，針對 IV 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的研究最為“模糊”。
盡管此次研究揭示了該系統(tǒng)靶向目標 DNA 以及招募特征蛋白的機制。不過，目前依舊不清楚為何這一系統(tǒng)主要存在于質(zhì)粒中，以及它和多重耐藥菌的抗生素基因到底有何關(guān)系，也不清楚為何該系統(tǒng)的靶標更加偏好質(zhì)粒而不是染色體 DNA。
因此，課題組將圍繞該系統(tǒng)與質(zhì)粒 DNA 間的相互作用展開，進一步確定它的功能和作用機制。同時，也會嘗試進行應(yīng)用層面的改造，希望將來可以真正用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
（來源：Molecular Cell）
博后期間曾獲一項美國化學獎
另據(jù)悉，在加入南科大之前，賈寧曾在美國紀念斯隆凱特琳癌癥中心做了三年多的博后研究。
博后期間，她和當時所在團隊闡述了古細菌的分子機制：即利用 RNA 靶向的 III 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)效應(yīng)復合物，可以系統(tǒng)性地介導靶 RNA 降解、DNA 酶活調(diào)節(jié)、以及自身免疫調(diào)節(jié)來抵御噬菌體[2]。
CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以通過識別、并降解入侵噬菌體的 DNA 或 RNA，來讓外源基因的表達歸為“沉默”。與此同時，噬菌體同樣進化出了相應(yīng)的防御工具 anti-CRISPR 蛋白，從而能以特異性的方式讓 CRISPR-Cas 系統(tǒng)失去活力。
基于上述工作，賈寧還和合作者揭示了 anti-CRISPR 蛋白 AcrVIA1 幫助噬菌體逃逸的分子機制。
對于細菌來說，它能利用傳統(tǒng) CRISPR-Cas 系統(tǒng)所具有的核酸酶活性，降解外源入侵的核酸，從而抵御噬菌體的入侵。
同時，核酸酶缺陷的的 I-F Cascade 系統(tǒng)，會被細菌用于 RNA 介導的 DNA 轉(zhuǎn)座。
而在博后期間的另一項工作中，賈寧和合作者闡述了細菌利用 Cascade-TniQ 復合物來識別靶 DNA 的機制[4]。
上述工作揭示了細菌 CRISPR-Cas 免疫系統(tǒng)抵御外源核酸入侵的分子機制。憑借這些工作，她在博后期間獲得了美國布拉瓦尼克區(qū)域青年科學家化學獎。
如今，她回到國內(nèi)任職已有兩年之久。未來其將繼續(xù)研究包含 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在內(nèi)的新型細菌免疫系統(tǒng)的分子機制，力爭更好地助力于開發(fā)相應(yīng)的生物技術(shù)工具，最終將其用于臨床疾病檢測與治療。
參考資料：
1.Cui, N., Zhang, J. T., Liu, Y., Liu, Y., Liu, X. Y., Wang, C., ... & Jia, N. (2023). Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment. Molecular Cell.
2.Mol. Cell, 2019a, 2019b, 2019c
3.Science, 2020
4.Cell Res., 2020
責任編輯：Rex_29
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