賈寧，目前在南方科技大學(xué)擔(dān)任副教授，主要研究微生物與宿主免疫系統(tǒng)。2022 年，她曾入選《麻省理工科技評(píng)論》“35 歲以下科技創(chuàng)新 35 人”亞太區(qū)榜單。
圖 | 賈寧（來(lái)源：南科大官網(wǎng)）
不到一年時(shí)間，好消息再次傳來(lái)。前不久，她和合作者成功揭開(kāi) IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的“神秘面紗”，讓學(xué)界對(duì)于 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的理解得以加深，為開(kāi)發(fā)相關(guān)基因編輯工具并將其用于臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
(資料圖片)
研究中，借助生物化學(xué)、微生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等手段，她和團(tuán)隊(duì)揭示了如下分子機(jī)制：細(xì)菌可以利用 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的免疫防御能力，抵御外源質(zhì)粒的入侵。
這一成果為了解 IV-A 型復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能做出重大貢獻(xiàn)，也為進(jìn)一步確定 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的體內(nèi)功能鋪平了道路。
日前，相關(guān)論文以《IV-A 型 CRISPR-Csf 復(fù)合物：組裝、dsDNA 靶向和 CasDinG 募集》（Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment）為題發(fā)在 Molecular Cell（IF 16），CuiNing 是第一作者，賈寧和南科大副教授黃鴻達(dá)擔(dān)任共同通訊作者。
圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：Molecular Cell）
盡管投稿過(guò)程耗時(shí)一年多。但是賈寧表示：“最終，評(píng)審專(zhuān)家評(píng)價(jià)稱(chēng)我們‘用冷凍電鏡解析了所有重要的功能狀態(tài)，特別是首次捕捉到了 IV 型 Csf 系統(tǒng)與效應(yīng)蛋白 CasDinG 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，代表著 IV 型研究的一個(gè)重大飛躍’。看到這樣的評(píng)價(jià)我真的很高興，這是對(duì)我們工作的極大肯定。”
（來(lái)源：Molecular Cell）
“神秘”的 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)
作為細(xì)菌的獲得性免疫機(jī)制，CRISPR-Cas 系統(tǒng)能夠“記住”曾入侵過(guò)的噬菌體或外源質(zhì)粒，當(dāng)后者再次入侵時(shí)，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以切斷它們的基因組，讓其無(wú)法復(fù)制和表達(dá)，從而抵御噬菌體或質(zhì)粒等外源核酸的入侵。
由于能夠特異性地識(shí)別 DNA/RNA，CRISPR-Cas 系統(tǒng)已被開(kāi)發(fā)成為一種高效的基因編輯工具，并被廣泛用于生物技術(shù)、臨床應(yīng)用、基礎(chǔ)研究等方面。
研究 CRISPR-Cas 技術(shù)的兩位科學(xué)家也因此獲得 2020 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。同時(shí)，該技術(shù)曾經(jīng)三次被 Science 評(píng)為年度十大科學(xué)進(jìn)展，可見(jiàn)其在科學(xué)領(lǐng)域的重要意義。
根據(jù)效應(yīng)蛋白的組成，CRISPR-Cas 系統(tǒng)可被分為兩大類(lèi)：第一類(lèi)（Class1）效應(yīng)蛋白，是由多個(gè) Cas 蛋白組成的復(fù)合物；第二類(lèi)（Class2）效應(yīng)蛋白，由單個(gè) Cas 蛋白組成。
目前，已經(jīng)得到鑒定的 CRISPR-Cas 系統(tǒng)累計(jì)包含六種（I-VI）。除了 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)外，其他類(lèi)型的功能和作用機(jī)制，均已得到詳細(xì)報(bào)道。
其中，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)是最為神秘的一類(lèi)。該系統(tǒng)又可進(jìn)一步分為從 IV-A 到 IV-E 等五種亞型。
IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的特殊之處在于，它更多存在于質(zhì)粒上而非存在于染色體上。并且，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)對(duì)于同一宿主的其他質(zhì)粒具有極強(qiáng)的靶向性，因此有可能會(huì)介導(dǎo)宿主中不同質(zhì)粒之間的競(jìng)爭(zhēng)。
耐藥菌感染，是當(dāng)下臨床治療中的棘手問(wèn)題。更嚴(yán)重的是，通過(guò)質(zhì)粒水平的轉(zhuǎn)移，耐藥基因會(huì)在細(xì)菌中傳播擴(kuò)散，進(jìn)而加劇微生物耐藥所帶來(lái)的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題。
近期，在臨床分離的多種耐藥肺炎克雷伯菌的質(zhì)粒上，學(xué)界也發(fā)現(xiàn)了 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的存在。另外，有研究表明該系統(tǒng)可以靶向其他質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)移基因，這暗示著 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)可能具備對(duì)抗攜帶耐藥基因質(zhì)粒的能力。假如這一能力確實(shí)存在，將有希望用于耐藥菌感染的治療。
而在目前已經(jīng)得到鑒定的 6 類(lèi) CRISPR-Cas 系統(tǒng)中，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)是唯一一種結(jié)構(gòu)與功能均處于未知狀態(tài)的系統(tǒng)。
正是 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的神秘作用機(jī)制以及巨大的臨床應(yīng)用潛力，引起了賈寧等人的極大興趣。
識(shí)別 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的“廬山真面目”
為了揭開(kāi)該系統(tǒng)的“真面目”，該團(tuán)隊(duì)使用銅綠假單胞菌的 IV-A 型系統(tǒng)，來(lái)對(duì)效應(yīng)蛋白進(jìn)行共同表達(dá)。
這時(shí)，效應(yīng)蛋白會(huì)和 crRNA 形成效應(yīng)復(fù)合物 CsfcrRNA。但是，課題組發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)的特征蛋白 Csf4（CasDinG）并不存在其中。
接著，通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)課題組證實(shí) CsfcrRNA 可以特異性地識(shí)別靶 dsDNA，后又利用冷凍電鏡單顆粒方法解析了 CsfcrRNA 與靶 dsDNA 結(jié)合復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，借此揭示了 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)的組裝、crRNA 成熟以及靶 dsDNA 識(shí)別的分子機(jī)制。
結(jié)構(gòu)分析和生化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，相比 I、II、V 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)，IV-A 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)能夠識(shí)別的 PAM 序列范圍更廣，這說(shuō)明其具備廣泛的 DNA 識(shí)別特性，暗示著其具有更大的應(yīng)用價(jià)值。
而在最初的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，他們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn) CasDinG 這一復(fù)合物。但是，在 IV-A 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)抵御外源質(zhì)粒入侵時(shí)，CasDinG 發(fā)揮著必不可少的作用。
為了探究 CasDinG 的具體功能，該團(tuán)隊(duì)又把 CasDinG 單獨(dú)地純化出來(lái)，通過(guò) X- 射線晶體學(xué)技術(shù)解析了 CasDinG 的結(jié)構(gòu)。
后來(lái)，他們發(fā)現(xiàn) CasDinG 是一種 5′-3′DNA 解旋酶，依賴(lài)于腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）而存在。
盡管 CasDinG 不能直接與 CsfcrRNA 形成復(fù)合物，但是 CasDinG 具有結(jié)合 DNA 的能力。
于是課題組猜測(cè)：是不是 CasDinG 能被 CsfcrRNA-dsDNA 三元復(fù)合物所招募？
為驗(yàn)證這一猜想，他們?cè)O(shè)計(jì)了不同版本的 dsDNA，最終證明上述猜測(cè)完全正確。
更有意思的是，進(jìn)一步的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在 ATP 的存在之下，CasDinG 能將靶 dsDNA 從 CsfcrRNA-dsDNA 復(fù)合物中解旋下來(lái)。
為進(jìn)一步探明上述現(xiàn)象，他們利用冷凍電鏡解析了 3? CasDinG-CsfcrRNA-dsDNA 的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) CasDinG 能夠和不同的 Csf2 亞基相互作用，這說(shuō)明 CasDinG 可能會(huì)沿著 Csf2 亞基進(jìn)行滑動(dòng)從而解開(kāi)靶 dsDNA。
而被解旋的單鏈 DNA，很有可能被細(xì)胞中的 DNA 酶所降解，從而導(dǎo)致目標(biāo)質(zhì)粒的降解。
綜合以上發(fā)現(xiàn)，該團(tuán)隊(duì)提出了一款模型，涵蓋了 IV-A 型 CRISPR-Csf 復(fù)合物組裝、靶向 dsDNA、招募 CasDinG 蛋白、以及 dsDNA 解離等過(guò)程。
目前，應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具是 DNA 靶向的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)和 CRISPR-Cas12 系統(tǒng)，兩者都屬于第二類(lèi)（Class2）效應(yīng)蛋白，即只由一個(gè)效應(yīng)蛋白組成，組成上相對(duì)簡(jiǎn)單因此更容易進(jìn)行操作。
但是，在識(shí)別 DNA 的時(shí)候，它們都得依賴(lài)靶向基因位點(diǎn)上特定的短 DNA 序列，這種序列的名字叫做 PAM 序列。并且，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)和 CRISPR-Cas12 系統(tǒng)可以識(shí)別的 PAM 序列比較少，導(dǎo)致其適用范圍較為局限。
因此，開(kāi)發(fā)新型基因編輯系統(tǒng)、拓寬 DNA 序列的編輯范圍，是領(lǐng)域內(nèi)的重要研究方向。
雖然 IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)，是由多個(gè)蛋白組成的復(fù)合物。但是，用于編碼這一系統(tǒng)的基因僅為 3159bp，比目前廣泛應(yīng)用的 spCas9（4104 bp）還要小。
這意味著，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)更容易被遞送到細(xì)胞之內(nèi)，臨床應(yīng)用潛力十分可觀。而且，它能識(shí)別更加寬泛 PAM 位點(diǎn)，可編輯范圍相對(duì)較大，適用范圍也更廣闊。
此外，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)也能存在于耐藥菌株之中，故能和耐藥基因相互關(guān)聯(lián)。這樣一來(lái)就能形成一個(gè)內(nèi)源系統(tǒng)，從而有潛力用于對(duì)抗日益嚴(yán)重的耐藥菌傳播。
同時(shí)，作為一種多亞基的復(fù)合物，IV 型 CRISPR-Csf 系統(tǒng)可以在多個(gè)位置耦聯(lián)其他效應(yīng)蛋白比如表觀修飾酶、熒光蛋白等，進(jìn)而能夠帶來(lái)更大的應(yīng)用范圍。
如前所述，在所有 6 大類(lèi) CRISPR-Cas 系統(tǒng)中，針對(duì) IV 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的研究最為“模糊”。
盡管此次研究揭示了該系統(tǒng)靶向目標(biāo) DNA 以及招募特征蛋白的機(jī)制。不過(guò)，目前依舊不清楚為何這一系統(tǒng)主要存在于質(zhì)粒中，以及它和多重耐藥菌的抗生素基因到底有何關(guān)系，也不清楚為何該系統(tǒng)的靶標(biāo)更加偏好質(zhì)粒而不是染色體 DNA。
因此，課題組將圍繞該系統(tǒng)與質(zhì)粒 DNA 間的相互作用展開(kāi)，進(jìn)一步確定它的功能和作用機(jī)制。同時(shí)，也會(huì)嘗試進(jìn)行應(yīng)用層面的改造，希望將來(lái)可以真正用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
（來(lái)源：Molecular Cell）
博后期間曾獲一項(xiàng)美國(guó)化學(xué)獎(jiǎng)
另?yè)?jù)悉，在加入南科大之前，賈寧曾在美國(guó)紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心做了三年多的博后研究。
博后期間，她和當(dāng)時(shí)所在團(tuán)隊(duì)闡述了古細(xì)菌的分子機(jī)制：即利用 RNA 靶向的 III 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)效應(yīng)復(fù)合物，可以系統(tǒng)性地介導(dǎo)靶 RNA 降解、DNA 酶活調(diào)節(jié)、以及自身免疫調(diào)節(jié)來(lái)抵御噬菌體[2]。
CRISPR-Cas 系統(tǒng)可以通過(guò)識(shí)別、并降解入侵噬菌體的 DNA 或 RNA，來(lái)讓外源基因的表達(dá)歸為“沉默”。與此同時(shí)，噬菌體同樣進(jìn)化出了相應(yīng)的防御工具 anti-CRISPR 蛋白，從而能以特異性的方式讓 CRISPR-Cas 系統(tǒng)失去活力。
基于上述工作，賈寧還和合作者揭示了 anti-CRISPR 蛋白 AcrVIA1 幫助噬菌體逃逸的分子機(jī)制。
對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，它能利用傳統(tǒng) CRISPR-Cas 系統(tǒng)所具有的核酸酶活性，降解外源入侵的核酸，從而抵御噬菌體的入侵。
同時(shí)，核酸酶缺陷的的 I-F Cascade 系統(tǒng)，會(huì)被細(xì)菌用于 RNA 介導(dǎo)的 DNA 轉(zhuǎn)座。
而在博后期間的另一項(xiàng)工作中，賈寧和合作者闡述了細(xì)菌利用 Cascade-TniQ 復(fù)合物來(lái)識(shí)別靶 DNA 的機(jī)制[4]。
上述工作揭示了細(xì)菌 CRISPR-Cas 免疫系統(tǒng)抵御外源核酸入侵的分子機(jī)制。憑借這些工作，她在博后期間獲得了美國(guó)布拉瓦尼克區(qū)域青年科學(xué)家化學(xué)獎(jiǎng)。
如今，她回到國(guó)內(nèi)任職已有兩年之久。未來(lái)其將繼續(xù)研究包含 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在內(nèi)的新型細(xì)菌免疫系統(tǒng)的分子機(jī)制，力爭(zhēng)更好地助力于開(kāi)發(fā)相應(yīng)的生物技術(shù)工具，最終將其用于臨床疾病檢測(cè)與治療。
參考資料：
1.Cui, N., Zhang, J. T., Liu, Y., Liu, Y., Liu, X. Y., Wang, C., ... & Jia, N. (2023). Type IV-A CRISPR-Csf complex: Assembly, dsDNA targeting, and CasDinG recruitment. Molecular Cell.
2.Mol. Cell, 2019a, 2019b, 2019c
3.Science, 2020
4.Cell Res., 2020
責(zé)任編輯：Rex_29
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