· 通過研究進化起源，科學家在真核生物中發現了“基因魔剪”CRISPR系統的“遠房表親”，有望實現更有效、精準的基因編輯。
·源于細菌的初代基因編輯療法，對人體具有自身免疫不良反應的潛在風險。而源于真核生物的新型基因編輯工具，理論上更加安全，未來或可成為CRISPR系統有力的替代性選擇。
【資料圖】
Fanzor 蛋白（灰色、黃色、淺藍色和粉色）與引導RNA（紫色）復合物及其靶標DNA（紅色和藍色）的冷凍電鏡結構圖。引導RNA用于指導Fanzor 蛋白對靶標DNA的基因編輯，其中紅色為DNA雙鏈中的目標鏈，藍色為非目標鏈。圖片來源：張鋒實驗室
在細菌免疫系統中發現的“基因魔剪”CRISPR-Cas9，成就了兩位女性諾貝爾獎得主，由此開發的首個基因編輯療法有望在今年獲批上市。多年來，科學界涌現了一股在大自然中尋找類似Cas9的核酸酶的“淘金熱”，希望打造出更為銳利和精準的基因編輯器，治療各種基因病。
如今，華裔基因編輯技術先驅張鋒朝這個目標又跨出了重要一步。來自美國麻省理工-哈佛博德研究所及麻省理工學院麥戈文腦研究所的張鋒團隊，首次在真核生物（藻類、真菌、植物和某些軟體動物）中發現了一種名為Fanzor的蛋白質，它和同屬CRISPR系統的Cas12酶擁有共同進化起源。經過系統工程改造優化后，未來Fanzor有望應用于新一代基因編輯器中。
相關論文于當地時間6月28日發表于頂級科學期刊《自然》（Nature）雜志。“這是研究生物多樣性力量的又一個例子，可能還有更多有趣和潛在有用的（基因編輯）系統等待被發現和利用。”張鋒對行業媒體Endpoints表示。
“這項研究最大的亮點是在真核生物中發現了RNA引導的基因編輯系統，因為和細菌等原核生物相比，在物種進化上真核生物離人類更近。”上海科技大學生命科學與技術學院教授、基因編輯中心主任陳佳告訴澎湃科技記者，由于之前發現的CRISPR系統主要來源于細菌并且往往是病菌，因此人體內可能已經存在Cas9蛋白的抗體，利用CRISPR-Cas9進行基因治療時，或許會引起一些不必要的免疫反應，造成不良的治療后果。
“基于Fanzor開發的新型基因編輯工具，將會為這類患者提供新的選擇，減少基因治療過程中的潛在風險。”陳佳補充道，目前基因編輯療法的臨床應用剛剛起步，主要針對嚴重威脅生命健康的單基因遺傳病等展開，臨床試驗招募的患者人數并不多，因此自身免疫不良反應方面的隱患可能尚未展現。
仍需優化，提高基因編輯有效性和安全性
CRISPR是最早在大腸桿菌的基因體中發現的一段規律性序列，后來被證明是細菌免疫系統機制。細菌遭到病毒攻擊后，會挑選病毒的一段DNA碎片插入自己的CRISPR序列，并生成互補的引導RNA。在病毒下次入侵時，細菌體內的Cas9活性酶就可以快速識別病毒DNA并將其切割摧毀。
基于這一原理，改造后的CRISPR-Cas9系統可以識別和切割與引導RNA互補的DNA序列，通過DNA修復機制進行基因編輯、插入或敲除。
2021年，通過重建CRISPR-Cas9系統的進化起源，張峰團隊發現了三種可編程RNA引導的核酸酶，其中TnpB可能是CRISPR-Cas12的祖先，推測TnpB也具備RNA引導的核酸酶活性。
張鋒團隊的最新研究表明，TnpB也可能是Fanzor蛋白的祖先。研究者測試了四種Fanzor酶與引導RNA配對的復合物，其中三種可以實現對目標DNA序列的編輯，編輯效率最高達到11.8%，與早期版本的CRISPR基因編輯系統相當。
研究者選擇了土壤里的真菌Spizellomyces punctatus中的Fanzor酶（SpuFz）作進一步優化，確定了三個可以改進其基因編輯效率的突變，使其對一種目標DNA序列實現了18.4%的編輯效率（大多數測試的靶標編輯效率約為10%～15%）。在引入這一系列突變后，Fanzor酶活性提高了10倍。
“我們仍然需要進一步設計這種酶，讓它比得上Cas9酶基因編輯效率的金標準。”張鋒談道，SpuFz的其中一個獨特優勢在于，它不像Cas12蛋白具有旁切活性（collateral activity），因此可以實現更有針對性的基因編輯。
旁切活性是基因編輯常被詬病的“脫靶效應”的可能機制之一。即核酸酶在RNA引導下切割DNA的同時，還會降解目標位點附近的DNA，可能導致非預期的DNA雙鏈斷裂，乃至引發細胞凋亡或癌變。
“這篇文章并沒有直接檢測Fanzor系統基因編輯的脫靶情況，我認為這種可能性仍然存在。”陳佳向澎湃科技記者介紹，目前針對Cas酶的大量優化工作，已經可以很好地降低其在脫靶位點的編輯效率，相信同樣的策略也可以應用在Fanzor系統開發上。
張鋒首次將CRISPR-Cas9應用于哺乳動物基因組編輯，獲得了關鍵專利，但與諾貝爾獎失之交臂。2020年，諾貝爾化學獎授予另兩位基因編輯研究先驅詹妮弗·杜德納（Jennifer Doudna，圖右）與埃馬紐埃爾·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）。圖片來源：Bloomberg
新型“迷你”基因編輯器，更易遞送入人體
在2021年的研究中，除了TnpB，張鋒團隊發現的可編程RNA引導的核酸酶還有IscB和IsrB。其隨后的研究表明，尺寸更小的IsrB很可能是IscB的前身，而IscB正是Cas9的祖先。
在IscB發現后不到兩年時間，經過對其大量優化和改造，中科院神經所研究員楊輝團隊開發出了兩個“迷你型”堿基編輯器，在真核細胞中的單堿基編輯效率最高可達92%。文章于今年5月25日發表于科學期刊《自然-方法》（Nature Methods）。
堿基編輯器是新一代基因編輯工具，又被稱作“基因鉛筆”，可以在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下，定向“擦除”和“重寫”基因組的單個堿基，因此也被認為有更好的安全性。
“新的此類核酸酶的挖掘，可以進一步擴展底層平臺性技術，構建新型堿基編輯器、先導編輯器等。”陳佳指出，Fanzor同樣也可用于新型基因編輯器開發，預期可能在近年內實現。
和IscB一樣，尺寸較小也是Fanzor的另一優勢。這類酶約含400～700個氨基酸，平均算來僅有常用Cas9酶的四成大小。目前常用的腺病毒載體有容量限制，越小的基因編輯器，越容易被遞送到人體內。
不過，在最近接受Endpoints的采訪中，張鋒表示，圍繞各類Fanzor蛋白組建新公司“還為時過早”。
公開資料顯示，張鋒至少已經成立了8家生物技術公司，涵蓋傳統CRISPR基因編輯、堿基編輯療法開發、基于CRISPR的分子診斷、新型基因工具開發等多個方向。首家成立的公司Editas Medicine持有CRISPR關鍵專利，但基因編輯相關項目的臨床試驗結果和開發進度落后于兩位諾獎得主創辦的公司。（詳見澎湃科技報道： 《基因編輯明星公司首個臨床試驗折戟，初代“基因魔剪”不被看好》）
“和其他新發現的核酸酶一樣，Fanzor距離臨床治療還有一段距離，需要提高編輯效率和系統穩定性、解決遞送問題等。”陳佳介紹，目前進入臨床的仍然只有基于CRISPR-Cas9系統的基因編輯療法，因為它發現得最早，全球諸多科學家集中大量精力和資源對其進行研究和改造，相對最為成熟。
打開基因編輯工具的天然“寶庫”
此外，陳佳還指出，在技術開發的角度外，張鋒團隊的這篇論文發現的這類新現象，提出了一個有意思的科學問題，值得科學界深入探索，“CRISPR系統在細菌體內發揮免疫功能，而真核生物有另外的防御系統，那么Fanzor蛋白在真核生物中天然的生理功能是什么？這篇文章沒有完全揭示，而是在‘討論’部分說有待研究。” 在他看來，Fanzor蛋白未知的生理功能對人體有危害的概率不大。
Fanzor 、CRISPR系統中的Cas12與兩者的共同祖先TnpB的結構對比。張鋒團隊論文指出，Fanzor的生理作用仍然未知，有待研究。圖片來源：論文截圖
此前，張鋒團隊將IscB、IsrB、TnpB命名為OMEGA家族，它們都由微生物基因組中的轉座子編碼。轉座子是一種遺傳元素，又被稱為“跳躍基因”，可以跨物種轉移，在基因組內移動并自行復制粘貼，對于促進生物多樣性和適應性發揮著重要作用。系統發育分析表明，Fanzor基因的直系祖先正是通過這種水平基因轉移機制（有別于親子代間的垂直遺傳），從細菌“跳躍”到了真核生物中。
張鋒過去的學生奧馬爾·阿布達耶（Omar Abudayyeh）和喬納森·古騰伯格 （Jonathan Gootenberg）目前和張鋒在麥戈文腦研究所共用一個實驗室。兩周前，他們在預印本網站bioRxiv上發布了他們關于Fanzor類蛋白基因編輯能力的研究，該論文正在科學期刊審稿過程中等候發表。
他們的工作主要集中于在真核生物中尋找不同的 Fanzor 蛋白并分類。他們將這些蛋白共同命名為 HERMES家族。目前看來，它們顯示出的基因編輯效率還低于張鋒發表的研究。阿布達耶在個人推特主頁上介紹，研究繪制了從TnpB到HERMES的進化路徑，發現HERMES已經進化出高密度的內含子和核入侵信號（NLS）序列，表明它在真核生物中經歷了廣泛和長期的適應性進化，可能獲得了新的功能。
“雖然HERMES可能在指導真核生物轉座子在基因組中的位移方面發揮作用，類似于TnpB蛋白，但這種作用的確切性質仍然未知。我們對研究HERMES在真核生物中功能的許多新方向感到興奮，并將其作為潛在（基因編輯）工具進行工程設計。”阿布達耶表示。
康奈爾大學華裔研究員柯愛龍（Ailong Ke）在接受Endpoints采訪時亦表示，張鋒團隊的最新研究“令人興奮”且“異常優雅”。他認為，源自真核生物的基因編輯系統可能已經進化到在大型和復雜的基因組中工作良好，理論上說，“對于真核基因編輯，它們可能更有效甚至更精確。”
“HERMES核酸酶在不同真核生物譜系及其相關病毒中的廣泛分布表明，真核生物中可能存在更多未知的RNA引導系統，為未來表征和開發新生物技術提供了豐富的資源。”阿布達耶還寫道。
參考文獻：
1. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06356-2
2. https://www.science.org/doi/10.1126/science.abj6856
3. https://www.nature.com/articles/s41592-023-01898-9
4. https://endpts.com/feng-zhangs-lab-unveils-new-fanzor-gene-editing-tool-made-from-eukaryotic-proteins/
責任編輯：Rex_30
營業執照公示信息