·“基因編輯藥物從體外的細(xì)胞治療往直接體內(nèi)治療過(guò)渡的過(guò)程中，對(duì)遞送載體提出了更高的要求，遞送載體成了體內(nèi)基因編輯藥物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵限速步驟。”
(資料圖片僅供參考)
·“這一系統(tǒng)在細(xì)胞靶向特異性方面展現(xiàn)出的出色效果令人振奮，但其遞送效率仍有一定的提升空間，體內(nèi)遞送的長(zhǎng)期安全性也需要更多更具說(shuō)服力的研究數(shù)據(jù)支撐?！?/p>
當(dāng)?shù)貢r(shí)間3月29日，美國(guó)麻省理工學(xué)院—哈佛大學(xué)博德研究所（Broad Institute of MIT and Harvard）張鋒團(tuán)隊(duì)在《自然》（Nature）雜志在線發(fā)表了題為《通過(guò)細(xì)菌收縮注射系統(tǒng)進(jìn)行可編程蛋白質(zhì)輸送》（Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system）的論文，他們通過(guò)AlphaFold輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開發(fā)了一種新的蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)——改造、利用獨(dú)特的細(xì)菌“注射器”將蛋白質(zhì)注射到人類細(xì)胞中。
張鋒團(tuán)隊(duì)論文截圖。
以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)（the Hebrew University of Jerusalem）的計(jì)算微生物學(xué)家阿薩夫·萊維（Asaf Levy）在接受《自然》采訪時(shí)表示，“這可能會(huì)對(duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生變革性的影響，它可以設(shè)計(jì)有效載荷和特異性，這是非?？岬摹！?
上?？萍即髮W(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王皞鵬教授向澎湃科技表示，這項(xiàng)研究為蛋白質(zhì)精準(zhǔn)遞送技術(shù)的設(shè)計(jì)和開發(fā)提供了新方向，為將來(lái)在基因治療、癌癥治療、生物防治、核酸遞送等領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。但相關(guān)應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究和開發(fā)。
“張鋒團(tuán)隊(duì)新開發(fā)的PVC遞送系統(tǒng)是團(tuán)隊(duì)針對(duì)目前基因蛋白藥物遞送難題的一次出色探索，他們巧妙地把細(xì)菌注射系統(tǒng)和基因編輯器遞送相結(jié)合，開創(chuàng)了一個(gè)新的非病毒遞送方向?！比A東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究員吳宇軒告訴澎湃科技,“這一系統(tǒng)在細(xì)胞靶向特異性方面展現(xiàn)出的出色效果令人振奮，但其遞送效率仍有一定的提升空間，體內(nèi)遞送的長(zhǎng)期安全性也需要更多更具說(shuō)服力的研究數(shù)據(jù)支撐。而針對(duì)遞送效率、特異性、安全性等的充分研究是臨床應(yīng)用前不可或缺的?！?
精準(zhǔn)、靈活的細(xì)菌“注射器”
內(nèi)共生細(xì)菌是一類特殊的細(xì)菌，可以寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)部，它已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的遞送系統(tǒng)，使其能夠分泌調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的生物因子。細(xì)胞外收縮注射系統(tǒng)（eCIS）就是一個(gè)例子，它是一種類似注射器的大分子復(fù)合物，可以通過(guò)在細(xì)胞膜表面誘導(dǎo)出一個(gè)刺突蛋白，從而將攜帶的蛋白質(zhì)有效載荷注入到真核細(xì)胞中。
2022年4月29日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所微生物學(xué)家江峰團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》（Science）雜志發(fā)表論文稱，他們可以在生物發(fā)光細(xì)菌Photorhabdus asymbiotica中操縱這種類似注射器的系統(tǒng)，將他們從哺乳動(dòng)物、植物和真菌中選擇的蛋白質(zhì)加載到注射器中。張鋒團(tuán)隊(duì)在論文中提到，類似的發(fā)現(xiàn)提高了eCIS用于治療性蛋白質(zhì)遞送的可能性，然而，這些遞送系統(tǒng)是否能在人類細(xì)胞中起作用，以及這些系統(tǒng)用來(lái)識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞的機(jī)制尚不清楚。
張鋒團(tuán)隊(duì)選擇了來(lái)自Photorhabdus asymbiotica的eCIS——PVC（Photorhabdus virulence cassette ），他們發(fā)現(xiàn)，PVC有效載荷蛋白的N端高度無(wú)序區(qū)域是其“包裝結(jié)構(gòu)域”，只要將其與想要遞送的蛋白融合，就能將其加載到PVC復(fù)合體中。隨后，他們利用預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的人工智能程序AlphaFold設(shè)計(jì)了修改尾部纖維蛋白（PVC13）的方法，使其能夠精準(zhǔn)地靶向人類細(xì)胞表面表達(dá)的不同蛋白。
PVC系統(tǒng)可以被重新編程以在真核細(xì)胞中定制蛋白質(zhì)遞送。圖片來(lái)源：張鋒團(tuán)隊(duì)論文
通過(guò)對(duì)eCIS的進(jìn)一步改造，張鋒團(tuán)隊(duì)可以使用這一系統(tǒng)遞送不同類型的蛋白載荷，他們已經(jīng)在體外實(shí)驗(yàn)中成功遞送了CRISPR基因編輯系統(tǒng)中的Cas9蛋白以及另一類用于基因編輯的鋅指蛋白。在小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這種經(jīng)過(guò)改造的遞送系統(tǒng)也可以將蛋白遞送到小鼠大腦的神經(jīng)元中。
這一PVC遞送系統(tǒng)將有哪些應(yīng)用潛力？王皞鵬介紹，它可以應(yīng)用于基因治療、癌癥治療、生物防治和核酸遞送四個(gè)方面。“雖然作者沒(méi)有在文中成功實(shí)現(xiàn)核酸的遞送，但是目前有研究利用病毒肽構(gòu)建病毒樣顆粒實(shí)現(xiàn)核酸的遞送將病毒肽與DNA結(jié)合，然后將病毒肽包裹在PVC內(nèi)，可能也可以利用PVC系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)核酸遞送?！?
具有高度靶標(biāo)特異性，但效率有待提升
吳宇軒的研究方向之一是通過(guò)CRISPR基因編輯治療以地中海貧血為主的血液疾病。在美國(guó)哈佛大學(xué)從事博士后研究期間，他完成了基于CRISPR且不依賴于病毒遞送的血紅蛋白基因治療方法的臨床前研究?；貒?guó)后，他領(lǐng)導(dǎo)完成了全球首個(gè)體外CRISPR基因編輯治療β-地中海貧血的成功案例。
吳宇軒表示，張鋒團(tuán)隊(duì)研發(fā)的PVC遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出高度的靶標(biāo)特異性，能有效地將載荷遞送到擁有特定表面受體的細(xì)胞中。尤其是在人和小鼠細(xì)胞的靶向特異性測(cè)試中，展現(xiàn)了接近100%的靶向特異性。另一方面，該系統(tǒng)的靶向特異性可以通過(guò)對(duì)尾部纖維蛋白的合理改造來(lái)實(shí)現(xiàn)，這表明PVC展現(xiàn)出的高特異性是便于改造和拓展的，這給利用該系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞或組織特異性的體內(nèi)蛋白靶向遞送提供了廣闊的想象空間。
另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，該遞送系統(tǒng)具有良好的安全性基礎(chǔ)?！白髡甙l(fā)現(xiàn)，PVC處理不會(huì)產(chǎn)生任何顯著的免疫細(xì)胞激活、炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、體重減輕或細(xì)胞毒性，表明PVC處理在該實(shí)驗(yàn)時(shí)間過(guò)程中沒(méi)有免疫原性或毒性。同時(shí)，顱內(nèi)注射后，PVC在大腦中只是短暫存在，不會(huì)持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。” 吳宇軒解釋，“當(dāng)然，長(zhǎng)期的安全性仍然需要更多謹(jǐn)慎細(xì)致的研究才能確定，尤其是系統(tǒng)性給藥的免疫原性如何尚不明了。”
王皞鵬也向澎湃科技表示，在將這一系統(tǒng)應(yīng)用于人類治療之前，需要解決的最主要問(wèn)題之一是確保遞送系統(tǒng)在人體內(nèi)的安全性和有效性。首先需要進(jìn)行更多體內(nèi)試驗(yàn)，以了解其生物相容性和藥物代謝動(dòng)力學(xué)，以及在不同的生物體內(nèi)的生物分布和遞送效果。其次，需要進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化PVC系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，以提高其蛋白遞送效率和靶向準(zhǔn)確性。
如果要實(shí)現(xiàn)在臨床上的廣泛應(yīng)用，還應(yīng)設(shè)計(jì)合理的生產(chǎn)工藝和流程以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)PVC遞送系統(tǒng)，并確保其質(zhì)量和純度。“因?yàn)镻VC遞送系統(tǒng)源于發(fā)光桿菌的毒力基因簇，在人體內(nèi)應(yīng)用時(shí)具備免疫原性，可能會(huì)被人體免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)抗原引發(fā)免疫應(yīng)答，從而降低PVC遞送系統(tǒng)的效率?！蓖醢債i說(shuō)。
吳宇軒指出，這一遞送系統(tǒng)的遞送效率仍有待提升?！霸撗芯恐姓故镜幕赑VC的遞送系統(tǒng)進(jìn)行體外細(xì)胞系基因編輯的效率僅有12%左右，距離各種疾病使用基因編輯進(jìn)行治療的效率閾值仍有差距。”
另一方面，如果要將該遞送技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)，考慮到遞送損耗以及體內(nèi)細(xì)胞所處環(huán)境的復(fù)雜性，該遞送系統(tǒng)所產(chǎn)生的編輯效率可能會(huì)進(jìn)一步下降?！芭c目前常用的AAV載體相比，基于PVC的遞送系統(tǒng)顆粒大?。s116nm）相較于前者（約25nm）較大，和納米脂質(zhì)體顆粒（LNP，約60-200nm）大概相當(dāng)。過(guò)大的包裝體積，可能給體內(nèi)實(shí)質(zhì)組織中的深層細(xì)胞的高效率遞送造成一定的困難。并且，基于本項(xiàng)和前人關(guān)于PVC系統(tǒng)的研究，我們推測(cè)，該系統(tǒng)的包裝遞送效率可能也會(huì)受到載荷蛋白大小的影響，這可能是該遞送系統(tǒng)針對(duì)體外細(xì)胞的編輯效率過(guò)低的一個(gè)可能的原因?！眳怯钴幗忉?，“現(xiàn)有的高效基因編輯工具相較于目前常用的遞送工具的有效容量來(lái)說(shuō)普遍偏大，這對(duì)包括新開發(fā)的PVC系統(tǒng)等胞外壓縮注射系統(tǒng)仍然是一個(gè)暫未克服的挑戰(zhàn)。”
基因編輯知名科學(xué)家為何轉(zhuǎn)向遞送系統(tǒng)研究？
張鋒是基因編輯領(lǐng)域先驅(qū)科學(xué)家。2013年1月，張鋒團(tuán)隊(duì)首次將CRISPR基因編輯技術(shù)應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞。2013年年底，張鋒及其他四位基因編輯先驅(qū)科學(xué)家合伙創(chuàng)立了基因編輯公司Editas Medicine，創(chuàng)始團(tuán)隊(duì)包括2020年因開發(fā)基因編輯技術(shù)而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)的詹妮弗杜德納（Jennifer Doudna），以及堿基編輯先驅(qū)劉如謙（David Liu）。
2023年2月，張鋒聯(lián)合創(chuàng)建的新銳基因編輯公司Aera Therapeutics完成了近2億美元融資，將進(jìn)一步優(yōu)化根據(jù)其實(shí)驗(yàn)室研究開發(fā)的蛋白納米顆粒（PNP）遞送平臺(tái)技術(shù)。劉如謙的研究團(tuán)隊(duì)也正在開發(fā)基于病毒樣顆粒（virus-like particles, VLP）的遞送工具。此外，還有多家新銳公司專注于開發(fā)創(chuàng)新載體。
吳宇軒也注意到了張鋒和劉如謙的動(dòng)向。他認(rèn)為，兩位基因編輯領(lǐng)域的知名科學(xué)家轉(zhuǎn)向遞送系統(tǒng)研究的一個(gè)重要原因是，基因編輯藥物從體外的細(xì)胞治療往直接體內(nèi)治療過(guò)渡的過(guò)程中，對(duì)遞送載體提出了更高的要求，遞送載體成了體內(nèi)基因編輯藥物臨床應(yīng)用的關(guān)鍵限速步驟。
據(jù)王皞鵬介紹，目前針對(duì)遞送載體的研究主要集中于蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)和核酸遞送系統(tǒng)。在蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)方面，越來(lái)越多的研究聚焦于蛋白質(zhì)遞送載體的優(yōu)化和改造，也有研究探索新型蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)。在核酸遞送系統(tǒng)方面，主要的方法又分為病毒載體和非病毒載體兩種。
吳宇軒解釋，相對(duì)成熟的病毒遞送系統(tǒng)，例如AAV，由于其在體內(nèi)極長(zhǎng)的表達(dá)時(shí)間，如若用于基因編輯器的遞送，有很大的安全隱患；而以LNP為主的非病毒遞送系統(tǒng)在mRNA遞送方面已經(jīng)展現(xiàn)出了巨大的潛力，在肌肉注射（如mRNA疫苗）和肝臟遞送（如遞送基因編輯器mRNA的體內(nèi)基因編輯藥物）等方面展示出了很好的成藥性以及出色的臨床結(jié)果，但是開發(fā)精準(zhǔn)肝臟外靶向的非病毒遞送載體，治療例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新一代mRNA或者基因編輯藥物，仍然缺乏接近臨床轉(zhuǎn)化的重大突破。
張鋒在接受《自然》采訪時(shí)表達(dá)了相似的觀點(diǎn)。他認(rèn)為，遞送系統(tǒng)的限制是基因編輯的主要瓶頸之一，大多數(shù)臨床試驗(yàn)只能編輯肝臟、眼睛或血細(xì)胞的基因組，因?yàn)檫@些實(shí)驗(yàn)使用目前的遞送方法完成。“我們沒(méi)有看到大腦或腎臟疾病得到解決，是因?yàn)闆](méi)有良好的遞送系統(tǒng)?！?
參考資料：
1.https://www.nature.com/articles/d41586-023-00922-4#ref-CR1
2.https://www.nature.com/articles/s41586-023-05870-7
3.https://mp.weixin.qq.com/s/VbH8_Dz_ajZUkdn_8qOvfw
責(zé)任編輯：Rex_03
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